Construction of A Microbial System for Efficient Degradation of Cellulose
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摘要: 筛选出能产生不同纤维素酶的10株纤维素降解菌, 系统地分析了各菌株的EG、CBH和BG酶等3类纤维素酶活.经各菌株优化组合、混合培养, 构建了一组由5株细菌(LCB03、LCB12、LCB52、LCD12和LCD51)组成、能协同作用的复合微生物菌系.经生理生化和分子水平鉴定, 这5株细菌分别为Pseudomonas citronellolis(香茅醇假单胞菌)、Stenotrophomonas malto-philia(嗜麦芽寡食单胞菌)、Pseudomonas aeruginosa(铜绿假单胞菌)、Pseudomonas aeruginosa(铜绿假单胞菌)和Flavobacterium mizutaii(水氏黄杆菌).复合菌系的各菌株可产生不同类型的纤维素酶, 且各类酶可以协同作用有效分解天然纤维素, 在纤维素类污染的治理与资源化利用中具有很好的应用前景.Abstract: Endoglucanase, exoglucanase and cellobiase activities of ten cellulose degradation isolates from piggery sludge and manure were analyzed.A complex microbial system was constructed by five bacteria named as LCB03, LCB12, LCB52, LCD12 and LCD51 respectively with different cellobiase activities from these isolates.Tested from the perspective of physiology and microchemistry as well as molecular level, these five bacteria were identified as Pseudomonas citronellolis, Stenotrophomonas maltophilia, Pseudomonas aeruginosa, Pseudomonas aeruginosa and Flavobacterium mizutaii, respectively.So far, there are few papers on cellulose degradation using S.maltophilia and F.mizutaii.Each of the five bacteria could produce different types of cellobiase that co-catalyze degrading natural cellulose effectively, and the microbial system therefore has great potential in cellulose-related pollution control and waste utilization.
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Key words:
- cellulose biodegradation /
- complex microbial system /
- construction /
- identification
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纤维素是自然界中最丰富的碳水化合物, 是一类可再生的重要资源和能源.纤维素不溶于水, 在环境中结构稳定、难降解, 并广泛存在于农作物秸秆、城市固体废物、畜禽养殖废弃物和造纸废水中, 是难降解污染物之一(Georgakakis and Krintas, 2000; 陈子爱和邓小晨, 2006; Angela et al., 2008).目前, 从环境中分离和选育纤维素酶高产菌株, 挖掘纤维素酶产生菌的资源, 利用微生物的酶解作用, 解决环境污染问题, 甚至转化为能源已成为国内外研究热点之一.
纤维素是大分子的聚集, 由结晶区和无定形区交错而成(Petersson et al., 2007).将天然纤维素分解, 必须依靠内切型葡聚糖酶、外切性葡聚糖酶和纤维二糖酶3种酶协同作用才能完成(李燕红和赵辅昆, 2005).虽然在前人的研究中, 已有大量关于纤维素降解菌的报道(卢月霞等, 2007; 顿宝庆等, 2008), 但所筛选的菌株往往产酶类型单一, 很难彻底分解天然纤维素.因此, 在自然状态下彻底降解纤维素, 要充分重视多种微生物之间的协同效应(Haruta et al., 2002).而目前在构建复合菌系, 各菌株协同作用降解天然纤维素方面的研究却鲜有报道.本文目的在于筛选构建能产生多种纤维素酶的高效纤维素降解菌系, 分析该菌系的各类纤维素酶活及其降解天然纤维素的能力, 并对该菌系进行生理生化以及分子水平的鉴定.
1. 实验材料及方法
1.1 主要实验仪器
紫外分光光度计(T61, 中国), 智能生化培养箱(PHX, 中国), PCR仪(Gradient S, 德国Eppendorf), 凝胶成像系统(EC3, 美国UVP), 电泳槽(DYCP-33A, 中国), 电泳仪(美国Bio-rad).
1.2 实验材料和主要试剂
1.2.1 样品来源
湖北省鄂州市郊某畜禽养殖场排污口沉积底泥和该养殖场畜禽粪便.
1.2.2 培养基
筛选培养基(g/L) : Na2HPO4 3.0, NH4NO3 0.8, MgSO4·7H2O 0.1, CaCl2 0.1, CMC-Na 2.0, 微晶纤维素粉1.0, 滤纸2.0, 稻草2.0, pH值7.0~7.2.
产酶培养基(g/L) : Na2HPO4 3.0, NH4NO3 0.8, MgSO4·7H2O 0.5, CaCl2 0.5, FeSO4·7H2O 0.01, MnSO4·H2O 0.01, ZnSO4 0.01, CMC-Na 10.0 (或微晶纤维素粉5.0或纤维二糖5.0), 蛋白胨1.0, 酵母提取物0.5, pH值7.0~7.2.
LB (g/L) : 蛋白胨10.0, 酵母提取物5.0, NaCl 10.0, 琼脂15 (固), pH值为7.0.
天然纤维素降解培养基(g/L) : Na2HPO4 3.0, NH4NO3 0.8, MgSO4·7H2O 0.5, CaCl2 0.5, FeSO4·7H2O 0.01, MnSO4·H2O 0.01, ZnSO4 0.01, 蛋白胨1.0, 酵母提取物0.5, 稻草2.0.稻草在加入前经沸水煮10 min, 以去除稻草中的可溶性物质, 灭菌后烘干备用.
1.2.3 主要试剂
微量生化鉴定管购自杭州微生物试剂厂, DNA提取试剂盒、PCR产物纯化试剂盒购自美国Promega公司, Taq、dNTP、DNA Marker、Rnase酶均购自日本Takara公司.
1.2.4 实验方法
(1) 纤维素降解菌的筛选.称取1 g样品, 用20 mL无菌水水洗, 8 000 r/min离心5 min, 弃上清, 再加20 mL水, 重悬土样.重复操作3次; 将样品转入装有100 mL筛选培养基的500 mL锥形瓶中, 30 ℃恒温静置培养至培养基浑浊.取5 mL菌悬液于装100 mL新鲜筛选培养基的500 mL锥形瓶中培养一周.重复操作5~6次, 将最后得到的菌悬液中取20 μL于LB平板上涂布.置30 ℃下恒温培养1~3 d, 挑取长势良好、菌落形态各不相同的菌落, 经多次纯化后保种备用.
(2) 刚果红染色鉴定法.将待鉴定的菌落经前期培养后, 点种到筛选培养基平板上, 30 ℃恒温培养2~4 d, 往培养皿中加入适量1 mg/mL的刚果红溶液, 染色1 h, 弃去染液, 加入适量1 mol/L的NaCl溶液, 洗涤1 h.若细菌产生纤维素酶, 则在菌落的周围会出现清晰的透明圈, 依据透明圈的直径大小选择产酶菌株.
(3) 纤维素酶活分析.将筛选的菌种前培养物接种到产酶培养基中, 于30 ℃、120 r/min培养1~2 d, 取样测定各菌株的纤维素酶活力.内切型葡聚糖酶、外切性葡聚糖酶、β葡萄糖苷酶活力测定以及计算方法按照国际理论应用化学协会(IUPAC)推荐的国际标准方法, 以每mL粗酶液每分钟产生1 μmol葡萄糖为一个国际单位, 计IU/mL(Ghose, 1987).
(4) 细菌鉴定.细菌生理生化特性的鉴定参考《常见细菌系统鉴定手册》(东秀株和蔡妙英, 2001), 细菌基因组DNA的提取、PCR产物的纯化参考Li et al. (2006), 细菌16S rDNA片段的扩增, 引物参照Weisburg et al. (1991)合成, 为P1:5’AGAGTTTGATCCTGGCTCAG3’; P2:5’GGTTACCTTGTTACGACTT3’.反应体系为: 在50 μL反应体积中, 加入5 μL10×PCR缓冲液, 7 μL MgCl2 (终浓度为3.5 mM), 1 μL模板DNA (< 0.1 μg), 0.5 μL P1和P2 (终浓度为0.5 μM), 1 μL dNTP (每种NTP 2.5 mM), 0.5 μL和Taq酶(1.25 U).PCR扩增条件为: 94 ℃预变性5 min; 94 ℃变性30 s, 60 ℃退火30 s, 72 ℃延伸1 min, 循环30次; 72 ℃终延伸10 min.细菌系统进化树的构建采用软件MEGA 4.0, 进化树的算法采用Neighbor-joining法, 进化树评估采用Bootstraping法.
2. 结果
2.1 刚果红平板初筛
纤维素分解菌能分泌纤维素酶而将平板培养基中的纤维素降解成小分子的低聚糖、纤维二糖和葡萄糖等, 在纤维素刚果红培养基上, 纤维素分解菌的菌落周围均能形成清晰的水解圈, 且水解圈的大小同酶活性的高低有一定的数量关系, 透明圈与菌落直径比值大致反映纤维素内切酶活力的高低.产酶越多, 透明圈越大; 产酶越快, 透明圈出现的越快.样品经分离纯化共得到36株细菌菌株.菌株培养2 d后, 经刚果红染色, 其中有10株菌的透明圈较大, 它们在刚果红初筛平板上的菌落直径和透明圈直径见表 1.
表 1 刚果红鉴别培养基透明圈直径(mm)Table Supplementary Table Degrading capability identification by Congo
刚果红纤维素平板透明圈筛选法虽直接快速, 但仅以水解圈大小作为菌株产纤维素酶活力大小的唯一定量指标并不可靠.因此, 需要将这10株细菌进一步实验, 分析各菌株纤维素酶系特点.
2.2 各菌株纤维素酶系分析
纤维素是一种直链聚合物多糖.将天然纤维素水解成葡萄糖, 必须依靠内切型葡聚糖酶(endo-1, 4-β-D-glucanse, EC3.2.1.4, 简称EG, Cx酶)、外切型葡聚糖酶(exo-1, 4-β-D-glucanse, EC3.2.1.91, 简称CBH, C1酶)和纤维二糖酶3种酶(β-glucanse, EC3.2.1.21, 简称BG酶)协同作用才能完成.EG酶作用于纤维素分子内部的非结晶区, 随机水解β-1, 4糖苷键, 将长链纤维素分子截短, 产生大量具有非还原性末端的小分子纤维素, 为CBH提供新的作用区.CBH酶作用于纤维素分子末端, 水解β-1, 4糖苷键, 每次切下一个纤维二糖分子, 生成可溶的纤维糊精和纤维二糖(李燕红和赵辅昆, 2005; Zhang et al., 2006).BG酶作用于纤维二糖生成葡萄糖, 虽然它对纤维素无作用, 但它可以消除上述两种酶催化反应转化出的中间产物对反应的抑制作用, 从而加快反应速度(Bahia and Ali, 2006).因此, 需要全面系统地分析菌株各种纤维素酶活, 找出各类纤维素酶活的优化组合, 为筛选高效天然纤维素降解菌系提供依据.
各菌株EG、CBH、BG酶活见图 1.10株细菌的酶活菌在7.0~16.0 IU/mL之间, 其中菌株LCB12和LCD51的EG酶活最高, 分别达到15.98 IU/mL和15.40 IU/mL, 高于魏桃员等(2004)、顿宝庆等(2008)报道的酶活.各菌株的CBH酶活介于EG酶和BG酶之间, 为2~9 IU/mL, 其中菌株LCB03和LCD12酶活最高, 分别达到8.53 IU/mL和10.60 IU/mL.各菌株的BG酶活与EG酶和CBH酶相比较小, 在1~3 IU/mL之间, 其中菌株LCB12和LCD51酶活最高, 分别达到2.68 IU/mL和1.74 IU/mL.从各菌株的3种纤维素酶活比较结果来看, 不同菌株的同一种酶活各不相同, 而同一菌株的3种纤维素酶活也存在较大差异.如菌株LCD51, EG酶活在各菌株最高, 但其CBH酶活却相对较低.而彻底降解天然纤素需要3种酶的协同作用.这也是单一菌株通常降解天然纤维素效率较低的主要原因.因此, 在实际应用中, 提高菌株降解天然纤维素的能力, 必须充分重视多种微生物之间的协同效应.
图 1 各菌株的3种纤维素酶活Fig. 1. Endoglucanase, exoglucanase and cellobiase activities of the ten isolates2.3 菌株混合培养结果分析
从上述10株细菌中选出各酶活较高的5株细菌, 分别是LCB03、LCB12、LCB52、LCD12和LCD51.将这5株混合培养, 两两混合点种于LB平板上, 定期观察菌种的生长情况.实验中未发现菌落因生长缓慢而被其他菌落覆盖的现象, 或菌落间互相接触时即被限制的现象.具体生长情况见表 2.结果表明, 各菌种混合后可以共存, 不相互拮抗.根据生态位的理论, 不同菌株能够在一起共存, 是因为它们之间通过协同作用出现了生态位的分离, 不存在生态位的重叠, 从而避免了种群间激烈的竞争(任南琪和马放, 2002), 各菌株之间的相容性为各菌株组合协同作用降解天然纤维素提供了基础.
表 2 平板混合培养情况Table Supplementary Table Growth of bacteria on mixed culture plates
2.4 复合菌系降解天然纤维能力测定
将上述5株菌株经过夜培养后的菌悬液, 以体积比1∶1混合, 将混合菌液接种到天然纤维素培养基中连续培养一周, 定期检测各酶活(图 2).从图 2可以看出, 复合菌系降解稻草过程中, 各酶活均呈现先增高、后降低的趋势.其中EG、CBH、BG酶活分别在第4、2、3天达到最高, 分别为3.15、1.12和0.55 IU/mL.复合菌系降解天然稻草的EG酶活优于曾青兰(2008)报道的菌株g76降解天然稻草的EG酶活(1.72 IU/mL).
图 2 复合菌系降解天然纤维素稻草的各种酶活Fig. 2. Endoglucanase, exoglucanase and cellobiase activities of degrading natural cellulose by composite microbial system稻草失重检测结果显示, 接种复合菌系的稻草失重为空白对照的1.6倍, 为0.36 g.
2.5 细菌鉴定
5株细菌的形态和主要生理生化特征分别见表 3.5株细菌的生理特征大部分相似, 如均为直杆菌, 均无芽孢, 革兰式染色均为阴性, 最适生长温度以及pH值相似.不同的是细菌LCB52和LCD12均为单极生鞭毛, 而细菌LCB03、LCB12和LCD51为周生鞭毛; LCD51不运动, 其余4株细菌运动.5株细菌的生化特征存在一定差别.它们均能利用葡萄糖、果糖和纤维二糖, 不能利用碳酸盐、氧化乙醇产酸.而在利用麦芽糖、淀粉水解、硝酸盐还原、产色素、氧化酶、接触酶和脂酶等方面不同.
表 3 五株细菌主要的生理生化特征Table Supplementary Table Main physiological and biochemical characteristics of five isolates
采用对16S rRNA序列测定和分析的方法对细菌进行分子水平的鉴定.PCR扩增得到长度为1 432、1 445、1 446、1 429和1 428 bp的扩增带(图 3).将菌株LCB03、LCB12、LCB52、LCD12和LCD51的16S rDNA序列提交国际GenBank登记, 序列号分别是: FJ194516、FJ194517、FJ194518、FJ194519和FJ194520.5株细菌的16S rDNA基因序列与GenBank数据库中的序列分别进行同源性比较发现, 细菌LCB03与Pseudomonas citronellolis(香茅醇假单胞菌)、LCB12与Stenotrophomonas maltophilia(嗜麦芽窄食单胞菌)、LCB52与Pseudomonas aeruginosa(铜绿假单胞菌)、LCD12与Pseudomonas aeruginosa(铜绿假单胞菌)、LCD51与Flavobacterium mizutaii(水氏黄杆菌)的多个菌株同源性达到98%~99%.将5株细菌的序列16S rDNA在网上BLAST比较分析后, 选取与该细菌同属和不同属的一些代表菌株的16S rDNA序列, 并用Clustal W和MEGA4.0软件构建系统发育树(图 4).从图中可以看出, LCD12、LCB52和LCB03三株细菌之间有较近的亲缘关系, LCB12与这3株细菌的亲缘关系相对于LCD51与这3株细菌更近.这与它们在形态特征、生理生化特征上的差异以及同源性比较的结果相一致.
图 4 菌株LCB03、LCB12、LCB52、LCD12和LCD51基于16S rDNA序列的系统发育树Fig. 4. Phylogenetic tree generated from an alignment of the 16S rDNA of strain LCB03, LCB12, LCB52, LCD12 and LCD51综合上述生理生化鉴定以及分子鉴定结果, 对照《细菌鉴定手册》, 菌株LCB03、LCB12、LCB52、LCD12和LCD51被分别鉴定为P. citronellolis(香茅醇假单胞菌)、S. maltophilia(嗜麦芽寡食单胞菌)、P. aeruginosa(铜绿假单胞菌)、P. aeruginosa(铜绿假单胞菌)和F. mizutaii(水氏黄杆菌).
3. 讨论
地球上每年光合作用产生大于100亿吨的植物干物质, 其中一半以上是纤维素和半纤维素.纤维素是数量最大的一类环境污染物.自然界中有机固体废弃物一半以上的成分是纤维素和半纤维素.纤维素也是畜禽养殖废水、造纸废水SS和COD的主要来源之一(Van Wyk and Mohulatsi, 2003; 陈子爱和邓小晨, 2006; Angela et al., 2008).生物法是目前处理废弃物和废水中纤维素的最为有效的方法.在能源日益紧缺的今天, 将固体废弃物和废水中的纤维素分解成葡萄糖、乙醇等小分子化合物, 转化为动物饲料、肥料或燃料等, 具有非常重要的意义(Hilden and Johansson, 2004).
本文从畜禽养殖场排污口沉积底泥和畜禽粪便中筛选得到5株高效纤维素降解菌, 经生理生化以及分子水平的鉴定, 复合菌系中细菌LCB03、LCB52和LCD12分别属于假单胞菌属的不同种, 细菌LCB12属于嗜麦芽寡食单胞菌, 细菌LCD51属于水氏黄杆菌.目前在国内外已有的研究报道中, 纤维素降解菌主要集中在纤维单胞菌(Cellulomonas)、嗜纤维菌(Cytophaga)、生孢嗜纤维菌(Sporocytophaga)、假单胞菌(Pseudomonas)、梭菌(Clostridium)和芽孢杆菌(Bacillus)(Bahia and Ali, 2006; Keikhosro et al., 2006), 而关于嗜麦芽寡食单胞菌和水氏黄杆菌降解纤维素的研究, 还几乎未见报道.复合菌系的各菌株可产生不同类型的纤维素酶, 且产生的各类酶活各有高低, 具有较强互补性.各菌株间可以共存, 协同作用有效分解天然纤维素, 具有很强的实际应用价值.
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图 1 各菌株的3种纤维素酶活
Fig. 1. Endoglucanase, exoglucanase and cellobiase activities of the ten isolates
图 2 复合菌系降解天然纤维素稻草的各种酶活
Fig. 2. Endoglucanase, exoglucanase and cellobiase activities of degrading natural cellulose by composite microbial system
图 4 菌株LCB03、LCB12、LCB52、LCD12和LCD51基于16S rDNA序列的系统发育树
Fig. 4. Phylogenetic tree generated from an alignment of the 16S rDNA of strain LCB03, LCB12, LCB52, LCD12 and LCD51
表 1 刚果红鉴别培养基透明圈直径(mm)
Table 1. Degrading capability identification by Congo
表 2 平板混合培养情况
Table 2. Growth of bacteria on mixed culture plates
表 3 五株细菌主要的生理生化特征
Table 3. Main physiological and biochemical characteristics of five isolates
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